En 1559 ingresa en el colegio de los Jesuitas donde hasta 1563 cursa humanidades, Juan aprovecha bastante en este colegio.

En 1563, cuando tiene veintiún años de edad, ingresa al convento de Santa Ana de los carmelitas, en Medina del Campo. Al vestir el hábito adopto el nombre de fray Juan de Santo Matía, profesó al año siguiente e inicio estudios universitarios en Salamanca.

En abril de 1567 se realizó el capítulo provincial de Castilla, en el cual el padre general, padre Rubeo nombre como perfecto (maestro) de estudiantes en el colegio de San Andrés a fray Juan.

Durante el verano de 1567 es ordenado sacerdote en Salamanca. Se desconoce la fecha exacta. En agosto de este mismo año celebra su primera misa en Medina, de este acontecimiento tampoco se tiene fecha.

Ese mismo mes coinciden en Medina Santa Teresa de Jesús, que fundaba ahí su segundo monasterio y Juan que había ido a celebrar su primera misa. Es aquí donde la providencia realiza el primer encuentro entre los santos. Juan manifestó a la Madre Teresa su idea de pasarse a los Cartujos, pero ella lo persuade, afianza en él la vocación carmelitana y le presenta el proyecto de una reforma en los frailes. Juan le dio su palabra para actuar en esta renovación con la única condición de que “no se tardase mucho”.

Fray Juan Volvió a Salamanca para continuar sus estudios. Concluido el curso académico en julio de 1568, regresó a Medina como pasante de estudios y predicador. En este lugar volvió a tratar con la Madre Teresa sobre la reforma y el 9 de agosto salió acompañándola a la fundación de Valladolid, donde se quedó para conocer de cerca el estilo de vida del Carmelo Teresiano.

Los primeros días de octubre sale de Valladolid hacia Duruelo para ir acondicionando la casa que sería el convento donde iniciaría su nueva vida. Santa Teresa le dio unas estampas de papel y un Cristo. Juan al llegar a Duruelo trabajó intensamente en el arreglo de la casa hasta fines de noviembre.

El 28 de noviembre de 1568 se inauguró el convento de Duruelo, iniciando así el Carmelo Teresiano entre los frailes. Juan renovó su profesión religiosa bajo la regla  no mitigada, cambiando su sobrenombre del de Santo Matía por el “de la Cruz”, siendo a partir de ese momento Fray Juan de la Cruz. Junto con él iniciaron la reforma los frailes Fray Antonio de Jesús (Heredia) y José de Cristo.

El 11 de junio de 1570 se trasladó su fundación de Duruelo a Mancera de Abajo (Salamanca), donde Juan prosigue con el mismo oficio que tenía en Duruelo, que era de suprior y maestro de novicios.

En enero de 1571 Juan acompañó a Santa Teresa a la fundación de Alba de Tormes, efectuada el 25 de enero. En abril fue nombrado rector del colegio de los descalzos en Alcalá de Henares.

En 1572 entre abril y mayo, Juan fue desde Alcalá a Pastrana para poner orden en aquel noviciado y regresó pronto a Alcalá, desde donde volvió a salir a fines de mayo hacia Ávila para tomar el cargo de confesor y vicario del monasterio de la Encarnación. En él habían puesto de priora a Santa Teresa, quien era la que había solicitado al Comisario apostólico la presencia de Juan como confesor. En este lugar permaneció con algunas pequeñas interrupciones hasta fines de 1577.

El día 2 de diciembre de 1577 fue apresado por los padre calzados y entre el 4 y 8 de este mismo mes, lo llevaron a Toledo, donde fue encerrado en la prisión conventual, que originalmente se había hecho para baño, por lo que solo tenía tres metros de largo por dos de ancho sin otra luz ni respiradero sino la de una pequeña ventana en lo alto.

Aquí en Toledo Juan es sometido a juicio y se le condena por “rebelde y contumaz”. Lo tratan de persuadir para dejar la reforma con promesas, halagos y le ofrecen un priorato, una buena biblioteca, una buena celda, una cruz de oro… fray Juan responde: “el que busca a Cristo desnudo, no ha de menester joyas de oro”. Al no aceptar las disposiciones del superior, es mantenido secuestrado por casi nueve meses.

En estas circunstancias tan difíciles para él como decisivas para su reforma, de total incomunicación física y espiritual, pues se le privó hasta el consuelo de celebrar la misa y sin otra lectura que la del breviario y un libro de devociones, Juan se dedica a cantar coplillas devotas, muchas de ellas compuestas por él mismo. Sin papel, sin tinta, sin apenas luz, fue cincelando versos de memoria, en espera de poder transcribirlos. Esa ocasión se le presentó meses más tarde, gracias a la benevolencia del nuevo carcelero que le proporcionó los útiles indispensables. Juan aprovechó estas facilidades para trasladar al papel aquellos versos, que ahora podía pulir y completar.

En la noche del 16 al 17 de agosto de 1578 entre las dos y las tres de la madrugada, se fuga de la cárcel descolgándose por una ventana usando su hábito en tiras sujetas entre sí como cuerda. Fray Juan con el hábito de calzado y rato. Sin escapulario, ni capucha, con su cuadernillo de versos, extenuado y consumido, apenas se mantiene en pie. Llega al monasterio de las carmelitas descalzas de Toledo donde se refugia. Durante los últimos días de agosto y la primera parte de septiembre permanece en la casa hospital de don Pedro González de Mendoza por encargo de las descalzas de Toledo.

Después de haber recobrado su libertad en octubre de 1578 es elegido superior del convento del Calvario (Jaén). El 13 de junio de 1579 inaugura el colegio de Baeza y queda como rector.

El 22 de junio de 1580 el papa Gregorio XIII autoriza la creación de una provincia independiente del Carmelo Descalzo y en marzo de 1581 asiste Juan de la Cruz al capítulo de Alcalá de Henares, siendo elegido tercer definidor. En 1582 toma posesión del priorato de los Mártires de Granada. En 1583, en el mes de mayo asiste al capítulo de Almodóvar y es confirmado en cargo prioral. El 11 de mayo de 1585 asiste al capítulo provincial en Lisboa y es elegido segundo definidor. En octubre se concluye el capítulo de Lisboa que fue interrumpido. Este se realiza en Pastrana. Es nombrado vicario provincial de Andalucía. Cesa su priorato de Granada.

En abril de 1587 viaja a Valladolid donde forma parte del capítulo provincial en el que cesa a todos sus cargos, pero se le nombra nuevamente prior a Granada.

El 18 de junio de 1588 se abre el primer capítulo general de la reforma, en éste es elegido como definidor general y tercer consiliario. El 4 de marzo de 1589 renuncia al priorato de Granada y pasa como prior de Segovia.

En 1590, en el mes de junio en capítulo general extraordinario, San Juan de la Cruz con toda libertad de espíritu se muestra contrario a las medidas e innovaciones propuestas por el padre Nicolás Doria y en junio del año siguiente, en el capítulo ordinario celebrado en Madrid, cesa en todos sus oficios, y vuelve a Segovia como conventual.

El 10 de agosto llega a la peñuela. A fines de septiembre comienzan a darle unas calenturillas (fiebres). Se le hincha la pierna derecha y tiene grandes dolores. Con la fiebre  que no se le quita y la hinchazón, sale de Peñuela el 28 de septiembre rumbo a Úbeda.

Aquí en Úbeda es tratado de mala forma por el prior, pero Juan lo lleva todo con amor. En la misma noche de su llegada a Úbeda le aumenta la fiebre y se le produce como una seca en el empeine del pie derecho. El médico corta con unas tijeras, desde el talón para arriba de la carne viva, Juan pregunta: “¿qué ha hecho?” el doctor respondió: “le he abierto a vuestra reverencia el pie y la pierna, y me pregunta ¿Qué he hecho?”. Juan añade: “si es menester cortar más, corte norabuena y hágase la voluntad de mi Señor Jesucristo”. La enfermedad avanza inexorablemente. Las cinco llagas en forma de cruz supuran mucha materia (pus).

El 7 de diciembre le aumenta la fiebre y el color de la materia que supura cambia de tono. Los médicos ven en esto un agravamiento irreversible. Juan pregunta: “¿qué día es hoy?”. Oída  la respuesta viendo una imagen de la Virgen dice: “¡Bendita seáis vos, Señora, que en vuestro día, sábado, queréis parta de esta vida!” los días 8, 9 y 10 pregunta lo mismo, pero nunca recibe la misma respuesta. El día 11 se confiesa una vez más., el día 12 pide una vela y el talego de cartas y las quema y el día 13 pide que venga el prior, a quien le suplica perdón con mucha humildad por las faltas que hubiese cometido y ruega que le den como limosna el hábito para ser enterrado. El prior que ya había ido cambiando le pide perdón y también su bendición y sale llorando de la habitación.

A las once y media los religiosos le van haciendo la recomendación del alma según el ritual. Juan pide que reciten los Cantares. En esto dan las doce  y tocan las campanas. Pregunta Juan “¿a qué tañen?”. A maitines le responden. Abre con dulzura los ojos y dice: “al cielo me voy a decirlos” y besando la cruz, oró “en tus manos encomiendo mi espíritu”. En el primer minuto del día 14 de diciembre de 1591 entregó su alma al Creador.

Fue beatificado el 25 de enero de 1675 por el papa Clemente X y canonizado por el papa Benedicto XIII el 27 de diciembre de 1726. Finalmente es declarado doctor de la Iglesia por el papa Pío XI el 24 de agosto de 1926.

San Juan de la Cruz en su figura ha sufrido una mitificación por los años, la literatura hagiográfica y los admiradores, se nos mostró por mucho tiempo a un santo extático, sublime y lejano. Cuando en realidad Juan de la Cruz ofrece un mensaje estimulante y seguro, válido hoy como ayer, se combinan y conjugan armoniosamente su experiencia personal con la reflexión científica de su doctrina.

Esta bella combinación logra abrirnos un sendero en la vida espiritual. Su magisterio fue fundamentalmente oral; si escribió, fue porque insistentemente se lo requirieron. Tema central de su enseñanza que lo ha hecho célebre dentro y fuera de la Iglesia Católica es unión por la gracia del hombre con Dios, por medio de Jesucristo: del grado más humilde al más sublime, en un itinerario que prevé las etapas de la vida purgativa, iluminativa y unitiva, en otras palabras, de los principiantes, intermedios y perfectos. Para llegar al todo, que es Dios, es preciso que el hombre dé todo de sí, no con espíritu de esclavo, sino de amor. Esto está encerrado en su pensamiento como “Al atardecer de se nos examinará en el amor” y “donde no hay amor pon amor y sacarás amor”.